NADPH 氧化酶（NADPH oxidase）试剂盒
（微板法 48 样）

一、产品简介： 

        NADPH 氧化酶（NAO）是一个典型的膜蛋白，催化 NADPH 氧化生成 NADP +，并 将电子传递给氧原子从而产生超氧阴离子。广泛存在于动物、植物和真菌中。该酶异常 可导致人慢性肉芽肿病（GCD），在植物中，该酶与其抗病性和各种胁迫有密切关系。 NADPH 氧化酶（NAO）将 NADPH 氧化为 NADP +的同时生成超氧阴离子(O2 . - )，接 着与显色剂反应生成水溶性的黄色物质。对照通过添加该酶的特异性抑制剂 DPI 排除背 景值。最终检测生成的有色物质在 450nm 处的吸光值，即可计算得出 NAO 酶活性大小。 

二、试剂盒组分与配制： 

三、所需的仪器和用品：

  酶标仪、96 孔板、低温台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。 

四、NADPH 氧化酶（NAO）活性测定：

   建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验 样本和试剂浪费！

1、样本制备

① 组织样本：

  取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，在 4ºC 或冰浴进行匀浆(或使用各类常见匀浆器)。 4ºC×12000rpm 离心 10min，取上清作为待测液。 【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取.

② 细菌/细胞样本： 

  先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 12000rpm 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10 4）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。

③ 液体样本：

   直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。

2、上机检测：

1  酶标仪预热 30min  以上，设定温度 37℃ , 调节波长至 450nm。

2  所有试剂解冻至室温（25℃)。

③ 在 96 孔板中依次加入：

【注】若△A 的值在零附近，可以延长反应时间 T（如至 40min 或更长），则改变后的反应 时间 T 需代入公式重新计算

五、结果计算：

1 、按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟在反应体系中使 450nm 处吸光值变化 0.01 为一酶活单位。

NAO(△OD450/min/mg prot）=ΔA÷（V1×Cpr）÷0.01÷T=250×ΔA÷Cpr

2 、按样本鲜重计算：

酶活定义：每克组织每分钟在反应体系中使 450nm 处吸光值变化 0.01 为一酶活单位。

NAO(△OD450/min/g  鲜重）=ΔA÷(W ×V1÷V) ÷0.01÷T=250×ΔA÷W

3 、按细菌或细胞密度计算：

酶活定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟在反应体系中使 450nm 处吸光值变化 0.01 为一酶活 单位。

NAO(△OD450/min / 104 cell）=ΔA÷(500×V1÷V) ÷0.01÷T=0.5 ×ΔA

 V---加入提取液体积，1mL；           V1---加入样本体积，0.02mL；

T---反应时间，20min ；                W---样本质量，g；

500---细胞或细菌总数，500 万；

Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。

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