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产品应用说明及产品应用领域

发布者:admin

发布时间:2020-06-22

点击量:22次

点击次数: 更新时间:2020-06-22 【打印此页】 【关闭

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

  测定意义:

  NP在一定的温度和中性pH条件下,催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点,中性蛋白酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。

  测定原理:

  中性条件下,NP催化酪蛋白水解产生酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝;在680nm有特征吸收峰。

  自备仪器和用品:

  可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5mL EP管和蒸馏水。

  试剂组成和配制:

  试剂一:液体×1 瓶,4℃保存。

  试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加4mL蒸馏水溶解。

  试剂三:粉剂×1 瓶,4℃避光保存。临用前加入4mL试剂一,沸水浴中磁力搅拌溶解。

  试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加20mL蒸馏水溶解。

  试剂五:液体×1 瓶,4℃保存。

  标准品:液体×1 支,0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液,4℃保存。

  粗酶液提取:

  1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一)冰浴匀浆,8000g,4℃离心10min,取上清,即粗酶液。

  2. 血清或培养液:直接测定。

  3. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后8000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。

  测定操作:

  1.分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到680nm,蒸馏水调零。

  2.试剂二、试剂三和试剂四置于30℃水浴保温30min。

  3.对照管:取0.5mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL试剂二,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入40μL试剂三,混匀后8000g,4℃离心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96 孔板,于680nm测定光吸收,记为A对照管。

  4.测定管:取0.5mL EP管,加入20μL粗酶液,40μL试剂三,混匀后置于30℃水浴保温10min;加入40μL试剂二,混匀后10000rpm 4℃离心10min;取40μL上清液,加入新的EP管,再加入200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96 孔板,于680nm测定光吸收,记为A测定管。(注意与空白管不同,先加试剂三,后加试剂二)

  5.空白管:取0.5mL EP管,加入40μL蒸馏水,200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm测定光吸收,记为A空白管。

  6.标准管:取0.5mL EP管,加入40μL标准品,200μL试剂四,40μL试剂五,混匀后置于30℃水浴保温20min,取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,于680nm测定光吸收,记为A标准管。

  注意:空白管和标准管只需要测定一次。

  计算公式:

  a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

  (1)按蛋白浓度计算

  NP活性单位定义:30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

  NP活性(nmol/min/mg prot)= C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(Cpr×V1)÷T= 3125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr

  (2)按样本质量计算

  NP活性单位定义:30℃每克样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

  NP活性(nmol/min /g)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(W×V1÷V2)÷T= 3125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W

  (3)按照液体体积计算

  NP活性单位定义:30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

  NP活性(nmol/min/mL)=C 标准品×(A测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×稀释倍数÷V1÷T= 3125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)

  (4)按照细胞数量计算

  NP活性单位定义:30℃每104个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

  NP活性(nmol/min /104cell)=C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×稀释倍数÷(细胞数量×V1÷V2)÷T= 3125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷细胞数量

  C 标准品:0.25 μmol/mL 标准酪氨酸溶液;稀释倍数:(20+40+40)÷40=2.5;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定,需要另外测定;建议

  称取同样质量的样品,加入1mL 蒸馏水匀浆提取离心后,用本公司蛋白质含量测定试剂盒

  测定;W:样品质量(g);V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),20μL=2×10 -2mL;V2:

  粗酶液总体积(mL),1mL;T:催化反应时间(min),10min。

  b.使用96 孔板测定的计算公式如下

  (1)按蛋白浓度计算

  NP活性单位定义:30℃每毫克蛋白每分钟水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

  NP活性(nmol/min /mg prot)= C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×稀释倍数÷(Cpr×V1)÷T= 3125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr

  (2)按样本质量计算

  NP活性单位定义:30℃每克样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

  NP活性(nmol/min/g)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×稀释倍数÷(W×V1÷V2)÷T= 3125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W

  (3)按照液体体积计算

  NP活性单位定义:30℃每毫升样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

  NP活性(nmol/min/mL)=C 标准品×(A测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×稀释倍数÷V1÷T= 3125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)

  (4)按照细胞数量计算

  NP活性单位定义:30℃每104个细胞每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

  NP活性(nmol/min /104cell)=C 标准品×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)×稀释倍数÷(细胞数量×V1÷V2)÷T= 3125×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷细胞数量

  C 标准品:0.25 μmol/mL 标准酪氨酸溶液;稀释倍数:(20+40+40)÷40=2.5;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL),注意该粗酶液不能直接用于蛋白质含量测定,需要另外测定;建议

  称取同样质量的样品,加入1mL 蒸馏水匀浆提取离心后,用本公司蛋白质含量测定试剂盒测定;W:样品质量(g);V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),20μL=2×10-2mL;V2:粗酶液总体积(mL),1mL;T:催化反应时间(min),10min。

  注意事项:

  临用前配制的试剂配制好后4℃保存,并且3 天内使用完毕。


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