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精氨酸酶检测方法
来源: | 作者:上海优选生物 | 发布时间: 2025-02-05 | 129 次浏览 | 分享到:
精氨酸酶是一种水解酶,它催化细胞内的L-精氨酸发生水解反应,生成鸟氨酸和尿素。一般情况下,能产生尿素的人或哺乳动物都含有,主要分布于肝脏、肾脏等部位。Fe2+、Co2+、Mn2+等金属离子能激活精氨酸酶,而Hg+、Ag+、柠檬酸和硼酸等会让它失活。精氨酸酶是一种双核含锰金属酶,在肝内精氨酸酶主要存在于细胞核和微粒体中。

精氨酸酶是一种水解酶,它催化细胞内的L-精氨酸发生水解反应,生成鸟氨酸和尿素。一般情况下,能产生尿素的人或哺乳动物都含有,主要分布于肝脏、肾脏等部位。Fe2+、Co2+、Mn2+等金属离子能激活精氨酸酶,而Hg+、Ag+、柠檬酸和硼酸等会让它失活。精氨酸酶是一种双核含锰金属酶,在肝内精氨酸酶主要存在于细胞核和微粒体中。



检测样本中的精氨酸酶活性,一般采用比色法或酶联免疫吸附(ELISA)法。


比色法,利用显色剂,与精氨酸酶反应中产生的尿素特异性结合,产生有色复合物。这个颜色的强度与样品中的精氨酸酶活性成正比,通过标准曲线的方法,计算含量。



酶联免疫吸附法是采用双抗体夹心的形式。也就是,往预先包被精氨酸酶(Arg)抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的精氨酸酶(Arg)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品活性。


1.  血清:使用不含热原和内毒素的试管,操作过程中避免任何细胞刺激,收集血液后,3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.  血浆:EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。3000转离心30分钟取上清。

3.  细胞上清液:3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.  组织匀浆:将组织加入适量生理盐水捣碎。3000转离心10分钟取上清。

5.  保存:如果样本收集后不及时检测,请按一次用量分装,冻存于-20℃,避免反复冻融,在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。



操作步骤

1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;

3. 样本孔先加待测样本10μL,再加样本稀释液40μL;空白孔不加。

4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液,静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。

6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

7. 每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。


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