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γ-氨基丁酸(GABA)检测方法
来源: | 作者:上海优选生物 | 发布时间: 2024-12-20 | 513 次浏览 | 分享到:
GABA,又称4-氨基丁酸,化学式为C4H9NO2,广泛存在于动植物和微生物中,具有抗逆和调控作用。检测GABA的方法包括高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、质谱(MS)和酶联免疫吸附(ELISA)法。HPLC法通过样品处理、色谱条件设置和标准曲线绘制来测定GABA含量;GC法需对样品进行衍生化处理,生成GABA衍生物后测定;MS法通常与液相或气相联合使用,通过质谱峰解析定量;ELISA法则采用双抗体一步夹心法,通过颜色变化和吸光度测定GABA浓度。

GABA别名是4-氨基丁酸,化学式为C4H9NO2,分子量为103.1,能溶于水,不溶于苯,乙醚等。是一种非蛋白质氨基酸,广泛存在于脊椎动物,植物和微生物中。常用溶剂萃取,柱分离制备,也有微生物发酵。在植物的生理代谢过程中,具有抗逆和调控作用。



检测方法:高效液相色谱(HPLC)法、气相色谱(GC)法、质谱(MS)法、酶联免疫吸附(ELISA)法等。


1.高效液相色谱法


样品处理:称取组织-加入裂解液-匀浆-超声-离心-取上清-过滤。


色谱条件:C18的色谱柱,柱温一般为30-40℃或指定的温度。流动相一般用甲醇和乙腈,或乙腈和三水合乙酸钠,流速为1.0ml/min,根据实际情况调整。紫外检测器,波长为338或248nm,在实际测定的过程中,需要进行方法验证,确定最佳的检测波长。进样量为10uL,进样测定。



标准曲线:将标准品进行稀释,成倍的,梯度稀释至少6个浓度。这几个浓度点要覆盖到检测器的最佳的检测范围之内,测定出来的色谱峰,对峰面积进行积分,结合对应的标准溶液浓度,可以绘制出标准曲线,得到回归方程。相关系数r2一般情况要大于0.999,重复性符合要求。方法学上,需要考虑回收率。


样品测定:样品的测定条件和标准品是一样的,记录出峰的情况。对色谱峰面积进行积分,根据标准曲线,是可以计算出样品的GABA含量。


2.气相色谱(GC)法


样品处理:前面的方法也是裂解-匀浆,接着是丙酮沉淀蛋白,离心取上清。不同的是,使用GC测GABA含量,是需要对样品的残留提取物进行衍生化处理,比如与10%乙酰氯异丙醇液和三氟醋酐进行酯化和酰化反应,生成GABA衍生物。



色谱条件:使用毛细管色谱柱,氢火焰离子化检测器。主要的是设置进样温度,柱温,梯度升温,载气氮气流速,进样分流比,空气或氢气压力等。


同样,采用标准曲线的方法,计算出样品中的GABA含量。可以参考文献,根据对应的方法测定。


3.质谱(MS)法


质谱一般是和液相或气相联合使用的,在前期的处理后,在色谱柱和流动相的分离提取,进入质谱离子源,形成碎片离子。在质谱的质量分析器内,电磁场的作用下,根据质荷比(m/z)进行分离,并到达最终的检测器上,形成质谱峰。对质谱峰进行解析,结合标准曲线,可以更准确的定量。



4.酶联免疫吸附法


采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附法(ELISA)。往预先包被γ氨基丁酸(GABA)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在浓酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的γ氨基丁酸(GABA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。


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