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植物一氧化氮含量检测方法
来源: | 作者:上海优选生物 | 发布时间: 2024-09-14 | 312 次浏览 | 分享到:
植物体内的一氧化氮(NO)主要通过一氧化氮合成酶途径和硝酸还原酶途径产生,作为信号分子调节植物生长和抗逆境。检测NO含量的方法包括水杨酸浓硫酸比色法和酶联免疫吸附(ELISA)法,前者通过测定2,3-二氨基萘衍生物的吸光度值来计算NO浓度,后者利用双抗体夹心法测定植物样本中的NO含量。

植物一氧化氮(NO)的来源,主要包括一氧化氮合成酶途径、硝酸还原酶途径等。NO是植物体内的一个关键的信号分子,调节生长素的含量,促进植物生长,延缓花和果实的衰老,促进种子的萌发,和植物激素相互作用调节气孔运动。在逆境中,还可以作为一种抗氧化剂。一氧化氮合成酶途径:它是依赖于精氨酸的NO合成酶,在植物体内通过催化精氨酸分解产生一氧化氮,为植物的生长发育及抗病方面起到了重要作用。硝酸还原酶途径:它是利用植物体内的硝酸还原酶,将植物内源性的硝酸盐还原为一氧化氮。



检测植物体内的NO含量,一般可以用水杨酸浓硫酸比色法、酶联免疫吸附(ELISA)法、光谱法、化学分析法等。


1.水杨酸浓硫酸比色法


植物体内的NO和水杨酸在浓硫酸的条件下发生反应,生成2,3-二氨基萘(DAN)的衍生物,它的吸光度值和一氧化氮的浓度是呈正相关。通过测定这个产物的吸光度值,制作标准曲线,根据测定样本中的吸光度值,可以计算出NO的含量。



采集植物组织,用液氮冷冻后研磨成粉末。称取适量,加入磷酸缓冲液,离心后取上清液备用。向试管中加入一定量的水杨酸和浓硫酸,水浴反应一定时间。反应完成后,将反应液移入比色皿中,使用分光光度计(540nm仅供参考)波长下,测定吸光度值。对NO标准品进行梯度稀释7个点,并按显色反应的方法进行操作,测定对应的吸光度值。以浓度为横坐标,对应的吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线,计算回归方程。以此,结合样品测定吸光度值,可计算出NO的含量。确保,测定样品的吸光度值在标准曲线范围内。


2.酶联免疫吸附(ELISA)法



这是一种采用双抗体夹心法测植物样本中的NO含量。用纯化的植物NO抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被NO抗体的微孔中依次加入植物NO提取样本溶液、和HRP标记的NO抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB和HRP酶的催化作用下转化为蓝色,并在酸的作用下转变为最终的黄色。颜色的深浅和样品中的NO含量呈正相关,在酶标仪450nm波长下测定吸光度值。通过标准曲线,可以测定植物样品中的NO浓度。


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