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几丁质酶活性的检测方法
来源: | 作者:上海优选生物 | 发布时间: 2024-09-03 | 253 次浏览 | 分享到:
几丁质酶主要来源于灰链霉菌,能催化几丁质水解为N-乙酰葡糖胺,广泛分布于微生物、动物和植物中。几丁质是含氮多糖类高分子,主要存在于甲壳类动物和真菌细胞壁中。几丁质酶通过水解作用生成壳二糖和单糖,对病原菌生长有抑制作用,常见于蕹菜、葱、玉米等植物。检测方法包括分光光度法,使用特定试剂和步骤测定几丁质酶活性。

几丁质酶主要来源于灰链霉菌,这种酶能够催化几丁质水解为N-乙酰葡糖胺。几丁质酶在自然界中分布广泛,主要存在于微生物、动物和植物体内。几丁质是广泛存在于自然界的一种含氮多糖类生物性高分子,主要的来源为虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官,以及真菌类的细胞壁等。几丁质酶作用于几丁质,首先通过水解作用得到壳二糖,N-乙酰-葡萄糖苷酶(几丁二糖外切酶)进一步切割二糖生成单糖,包括N-乙酰-D-葡萄糖胺。几丁质酶是一种重要的植物防御酶,它能够降解真菌细胞壁的主要成分几丁质,对病原菌的生长具有直接的抑制作用。含几丁质酶活较高的有蕹菜、葱、玉米等。



检测方法:分光光度法,参考《GB/T34799-2017几丁质酶活检测方法》。


所用试剂:200mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0),12.5mg/mL几丁质悬浊液,2.5mol/L酒石酸钾钠溶液,96mmol/L3,5-二硝基水杨酸溶液,显色剂,10mmol/L对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷溶液,β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶溶液,0.5mg/mL N-乙酰-D-葡萄糖胺标准溶液。



样品准备:称取10mg样本,用200mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.0)溶解,并适当的稀释。取出2个离心管,一个是试验,一个是空白。其中,试验管加入0.8mL的12.5mg/mL几丁质悬浊液和0.2mL样品溶液,空白管加入0.8mL的12.5mg/mL几丁质悬浊液和0.2mL的水,塞好塞子,旋涡振荡,在37℃反应2h。反应结束,用100℃水浴终止反应,冷水浴冷却到37℃。2个试管中分别加入0.16mL的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶溶液,37℃涡旋震荡反应30min,离心后取上清。


取6个试管编号0-5,用于做标准曲线。依次加入0.5mg/mL N-乙酰-D-葡萄糖胺标准溶液0.0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL,加水1.5,1.4,1.3,1.2,1.1,1.0mL,再分别加显色溶液0.75mL。另外取2个试管,一个是试样,一个是空白。试样中依次加入0.5mL试验,1.0mL水,0.75mL的显色溶液,空白加入0.5mL空白对照上清,1.0mL水,0.75mL显色溶液。100℃水浴5min,冷却到室温,在分光光度计540nm波长处测定吸光度值。制作标准曲线,并根据测定样品的吸光度值,计算出样品中的几丁质酶活性。


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