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腺苷脱氨酶活性检测方法
来源: | 作者:上海优选生物 | 发布时间: 2024-08-27 | 155 次浏览 | 分享到:

腺苷脱氨酶(简称ADA)是一种参与嘌呤代谢的酶,主要作用是拆解食物组织中核酸的腺苷,它参与了免疫细胞的制造。ADA主要以单体和二聚体复合物的形式存在,活性位点上含有锌离子。这种酶在细菌、植物、脊椎和哺乳动物中发现,具有高度的氨基酸序列保守性。这里介绍几样科研检测方法,仅供参考。



ADA活性检测方法,主要有比色法和酶免法。


1.(波式)比色法


这是一种常用的测定ADA活性的方法,样品中的ADA是一种酶,它能够催化腺嘌呤核苷水解脱氨,产生次黄嘌呤核苷和氨离子。其反应公式为:腺苷+H2O→次黄嘌呤+NH3。通过分光光度计检测540nm处吸光度,氨离子和特定的显色剂反应生成有色化合物。通过测定有色化合物的吸光度值,计算出样本中的ADA的活性。


假如我们测的是细胞,取适量的样本进行匀浆,低速离心,取上清液备用。对标准品,要进行梯度稀释,在操作的过程中避免出现气泡,依照反应原理加入腺嘌呤核苷,发生反应,并在预定的条件下加入显色剂。混匀,室温静置10-15min,一般应数小时内检测完毕。根据测定的吸光度值,计算出样本中的ADA的活力值。酶活力高于上限者,应将样品稀释后重新测定,结果乘以稀释倍数。计算公式略,可以参考相关的试剂盒说明书或标准操作规程。



2.酶联免疫吸附(ELISA)法


这是用双抗体夹心法测定的,微孔板的微孔中被固定了ADA捕获抗体,向这样的微孔中依次加入ADA溶液和标准品,再加入HRP标记的检测抗体,形成抗体-抗原-抗体复合物,洗涤后加入底物TMB显色。颜色的深浅和ADA的浓度是呈正相关的,用酶标仪在450nm的波长下,测定吸光度值,根据标准曲线,可以测定样本中的ADA活力值。这个大多是以ELISA试剂盒的形式,详细步骤和注意事项可以参考使用说明书。


除了上述方法外,还有利用紫外分光光度法检测底物腺苷和产物在紫外265nm处吸光度差异来计算,以及通过高效液相色谱(HPLC)分析样本中腺苷脱氨酶活性。


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