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细胞ATP含量检测方法
来源: | 作者:上海优选生物 | 发布时间: 2024-08-20 | 493 次浏览 | 分享到:

ATP的中文名为腺嘌呤核苷三磷酸,又称为三磷酸腺苷。它是由一分子腺嘌呤,一分子核糖和三分子磷酸基团连接而成的。水解的时候,ATP释放的能量比较多,是生物体内最直接的能量来源。ATP是一种不稳定的高能磷酸化合物,在细胞中和ADP相互转化,从而保证了细胞各项生命活性的能量供给。生成ATP的途径有两种,一种是植物体内含有叶绿体的细胞,在光合作用下生成ATP,另外一种是细胞通过呼吸作用生成ATP。



检测细胞ATP含量的方法有多种,其中,常见的有高效液相色谱(HPLC)法、分光光度法、电泳法等。


1.高效液相色谱(HPLC)法


HPLC法能够准确、快速测定细胞中的ATP含量。在ATP分子中,有三个磷酸基团。这些磷酸基团是可以被水解成无水磷酸盐的,通过测定ATP水解产生的无水磷酸盐的含量,就可以间接的推断处样品中的ATP含量。这里需要注意的是,要将ATP分子中的磷酸基团,尽可能全部的发生水解作用。选择适合的液相色谱条件,应选择聚乙烯含磷柱等适合分离磷酸盐的色谱柱,从样品溶液中分离并检测出无水磷酸盐。在计算机软件中记录每个峰的保留时间、峰高、峰面积。对标准品进行梯度进样,测定对应的峰面积,并以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标制作标准曲线,计算回归方程,回收率。最后,根据样品检测出来的峰值,结合标准曲线,计算出样品中的ATP含量。



也有采用荧光色谱法的,选择合适的色谱柱、流动相和荧光检测条件能够准确检测ATP含量。对样品有效处理外,更关键的是色谱检测条件和参数,在色谱柱、流动相、柱温、流速、进样量、检测器等方面,实现最优化组合。使用标准ATP稀释一系列不同浓度的标准溶液,测定各标准溶液的荧光强度。以ATP浓度为横坐标,荧光强度为纵坐标,绘制标准曲线。根据标准曲线,通过比较样品中ATP的荧光信号与标准品的荧光强度,计算样品中ATP的含量。


2.分光光度法


可以用紫外分光光度法来测定ATP的含量,是因为ATP腺嘌呤的碱基上存在有共轭双键,这个双键在340nm的波长下具有强的吸收峰。对于细胞和组织样品,需要进行破碎、匀浆和离心等操作,以释放细胞内的ATP。通过标准品梯度稀释6个点,测定其吸光度值,制作标准曲线。根据对样品的提取和处理,在同样的条件下上机检测,可以重复3次,以求取平均值。根据测定的数值,结合标准曲线,计算出样品中的ATP含量。现在,有的已经采用ATP试剂盒的形式,可以根据说明书,有详细的操作步骤参考。


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