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HPLC测定半胱氨酸含量
来源: | 作者:上海优选生物 | 发布时间: 2025-07-08 | 47 次浏览 | 分享到:
半胱氨酸属于非必需氨基酸,是脂肪族含巯基的极性α-氨基酸,人体的条件必需氨基酸和生糖氨基酸。半胱氨酸可由体内的蛋氨酸(甲硫氨酸,人体必需氨基酸)转化而来,它是不稳定的化合物,容易氧化还原,与胱氨酸相互转换。半胱氨酸是谷胱甘肽的组成之一,它能加速自由基的老化。它的主要作用包括抗氧化和解毒,蛋白质合成和组织修复,免疫调节和代谢辅助等。主要用于医药、化妆品、生化研究等方面。

半胱氨酸属于非必需氨基酸,是脂肪族含巯基的极性α-氨基酸,人体的条件必需氨基酸和生糖氨基酸。半胱氨酸可由体内的蛋氨酸(甲硫氨酸,人体必需氨基酸)转化而来,它是不稳定的化合物,容易氧化还原,与胱氨酸相互转换。半胱氨酸是谷胱甘肽的组成之一,它能加速自由基的老化。它的主要作用包括抗氧化和解毒,蛋白质合成和组织修复,免疫调节和代谢辅助等。主要用于医药、化妆品、生化研究等方面。


检测方法:高效液相色谱(HPLC),一般有前处理、色谱条件、标准曲线、样品含量测定等过程。


1.样品提取(水解+衍生)


称取0.2g样品,放到15ml的离心管中,加入2ml的6mol/L的盐酸,振荡混匀5min。放到105℃的烘箱水解24h。用6mol/L的NaOH溶液调节到中性,用水定容到5mL。振荡5min,4000r/min离心10min,取上清0.5ml衍生。


将0.5ml的上清液,放到15ml的棕色离心管中。依次加入pH=9.0的碳酸氢钠缓冲液和DNFB各0.5ml,放入到60±0.5℃水浴中,避光反应60min。取出立即用冷水冷却至室温,加入3.5ml pH=7.0磷酸缓冲溶液,充分混匀,室温避光反应15min,取上清液过0.22μm 滤膜,待液相色谱测定。


2.色谱条件


C18色谱柱:250*4.6mm; 5μm,柱温38℃。A:乙腈:甲醇=90:10   B:0.02mol/L磷酸二氢钠+磷酸氢二钠 为流动相,梯度洗脱,流速1ml/min。DAD检测器,波长360nm,进样量10-20uL。


3.标准曲线


配制半胱氨酸的标准母液,并梯度稀释至1mg/L,5mg/L,10mg/L,20mg/L,50mg/L,100mg/L。依次进样到HPLC,测出各个浓度的色谱图。对色谱峰的面积进行积分,拟合标准曲线,得到回归方程。


4.含量测定


将衍生后的样品进样到HPLC中,根据标品的保留时间,可找到目标的色谱峰。对半胱氨酸的色谱峰面积进行积分,并代入到回归方程,可计算出样品溶液中的半胱氨酸含量。


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