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乙酰辅酶A(CoA)测定方法
来源: | 作者:上海优选生物 | 发布时间: 2025-01-15 | 227 次浏览 | 分享到:
乙酰辅酶a,简写为CoA。它是辅酶A的乙酰化形式,或者活化了的乙酸。它是脂肪酸β氧化,以及糖酵解后产生的丙酮酸氧化脱羧的产物。在很多的代谢过程中,CoA都起着比较关键的作用。糖类,脂肪,蛋白质彻底氧化,都会产生CoA,之后进入到三羧酸循环和氧化磷酸化,最终生成二氧化碳和水,释放出能量用于ATP的合成。CoA是合成脂肪酸、酮体、胆固醇及衍生物的前体物质。

乙酰辅酶a,简写为CoA。它是辅酶A的乙酰化形式,或者活化了的乙酸。它是脂肪酸β氧化,以及糖酵解后产生的丙酮酸氧化脱羧的产物。在很多的代谢过程中,CoA都起着比较关键的作用。糖类,脂肪,蛋白质彻底氧化,都会产生CoA,之后进入到三羧酸循环和氧化磷酸化,最终生成二氧化碳和水,释放出能量用于ATP的合成。CoA是合成脂肪酸、酮体、胆固醇及衍生物的前体物质。



检测方法包括高效液相色谱(HPLC)法、质谱(MS)法、酶联免疫吸附(ELISA)法等。


1.HPLC


获取新鲜的植物样本,用液氮冷冻后,加入聚乙烯聚吡咯烷酮,去除多酚,防止样品氧化。接着,研磨成粉末状。称量,加入纯水,振荡混匀,离心,取上清液,过0.22um滤膜,待测。具体步骤,可以参考相关的检测方法。



色谱条件:C18的色谱柱,设置35-40℃的柱温;以甲酸铵和乙腈为流动相(等度洗脱),0.5-1ml/min,紫外检测器,进样量10-20uL。


标准曲线:标曲是一种外标法,目前在科研检测过程中使用较为普遍,它能更准确的计算出样品中的CoA的含量。采用5-7个点,让它们在检测器优良的检出限范围内。以色谱峰的积分面积为纵坐标,对应的标准溶液浓度为横坐标,可以绘制出标准曲线。回归方程的相关系数r2>0.999,近似于直线。它就像一把尺子,尺子做好了,就要测量样品了。


样品测定:将处理好的样品,根据摸索出来的较好的色谱条件,和标准品相同的方法,测出色谱峰。对峰面积进行积分,结合标准曲线的回归方程,可以计算出乙酰辅酶a的含量。这里需要注意的是要考虑稀释倍数,回收率,重复性等要素。


2.质谱法



一般是串联了液相色谱,即LC-MS的形式测定。需要设置电离源模式,比如ESI,正离子模式,氮气,雾化气压力,ESI的电压,干燥气的温度和流速,监测模式如多反应监测(MRM)等,根据测定出来的质谱峰,确定目标化合物。根据标准曲线,可以更准确的计算出样品中的乙酰辅酶A的含量。


3.酶联免疫吸附(ELISA)法



往预先包被乙酰辅酶a的微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的乙酰辅酶a呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。具体操作步骤,参考相关的检测说明书。


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