丙酮酸脱氢酶主要发生在线粒体内，通过催化丙酮酸分子，将丙酮酸转化为乙酰辅酶A。在糖酵解的过程中，丙酮酸脱氢酶将丙酮酸转化为乙酰辅酶A后，进一步参与到柠檬酸循环，并为细胞提供一定的能量。它是一组多酶反应体系，包括酶和辅助因子，共同起作用完成反应。

测定丙酮酸脱氢酶活性的方法，主要是分光光度法。

分光光度法，是利用底物和产物在特定波长的光线下吸收强度不同，通过测定反应物的减少或产物的增加情况，来客观量化指标。因为丙酮酸脱氢酶是一组酶，要测它的活性，就要通过测定反应物或产物的变化，来间接得到它的催化能力，也就是活性。

比如，丙酮酸脱氢酶催化丙酮酸脱氢，并还原2,6-二氯酚靛酚，在波长为605nm处，可以测定反应的变化。通过测定反应前后吸光度的变化，来间接计算出丙酮酸脱氢酶的活性。现在大多数以试剂盒的形式，在微孔板上完成反应，根据说明书的操作步骤及注意事项，能节省大量的时间和精力，具体还有看试剂盒的品质以及操作过程对结果的影响。测定过程，需要对分光光度计进行预热，做空白对照。

除了分光光度法和试剂盒法外，还有一些其他方法可用于测定丙酮酸脱氢酶的活性，如荧光法、电化学方法等。具体选择哪种方法取决于实验条件、样本类型以及测定精度等。