维生素A族化合物在调节和控制多种正常组织和上皮细胞增殖分化，生长发育，神经系统功能调节，以及内环境的稳态具有重要作用。视黄醇，全反式视黄酸，9-顺式视黄酸， 全反式视黄醛作为视黄醇代谢通路上的功能物质，同时检测这四种物质，对生理功能研究十分重要。

     检测方法包括以下步骤：

(1)配制目标待测物的标准储备溶液、标准曲线工作液以及内标溶液；

(2)血液样本经处理后得到检测样本；

(3)利用HPLC-MS/MS对添加内标溶液的标准曲线工作液进行检测，以目标待测物与对 应的同位素内标的色谱峰峰面积比为纵坐标，以标准曲线工作液中目标待测物的浓度为横 坐标，分别拟合得到目标待测物对应的标准曲线方程，利用HPLC-MS/MS对添加内标溶液的 检测样本进行检测，根据对应的标准曲线方程计算得到检测样本中目标待测物的含量；其 中 ，HPLC-MS/MS检测的色谱条件为：

色谱柱：ACE PFP柱(100x2.1    mm,2.6μm,);

流动相A:甲醇：乙腈：水：甲酸=300:400:300:0.1;

流动相B:甲醇：乙腈：水：甲酸=300:550:150:0.1;

Strong   wash溶液：80%甲醇；

流速0.3mL/min,柱温为30℃,进样5μL;

采用梯度洗脱方式，梯度洗脱方式如下：流动相A的体积分数+流动相B的体积分数= 100%;其中：

0-3min流动相A的体积分数由15%下降至0;

3-4min 流动相A的体积分数维持在0;

4-4.1min 流动相A的体积分数由0%上升至15%;

4.1-5min 流动相A的体积分数维持在15%,直至5.2min停止。

一种基于HPLC-MS/MS的视黄醇，全反式视黄酸，9-顺式视黄酸 和全反式视黄醛检测方法，其特征在于：所述HPLC-MS/MS检测的质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源，正离子模式；

离子喷雾电压(IS):4500V;

离子源温度(TEM):450℃;

离子源雾化气(GS1):40psi;

离子源加热辅助气(GS2):45psi;

气帘气(CG):40psi;

扫描模式：MRM,MRM参数条件如下：

视黄醇：Q1,269(m/z);Q3,93(m/z);T,60(msec);DP,50(V);EP,7(V);CE,15(V);CXP, 12(V);

9-顺式视黄酸：Q1,301(m/z);Q3,122.8(m/z);T,60(msec);DP,60(V);EP,10(V);CE, 20.91(V);CXP,20(V);

全反式视黄酸：Q1,301(m/z);Q3,123.1(m/z);T,60(msec);DP,60(V);EP,8(V);CE, 19.66(V);CXP,15(V);

视黄醛：Q1,285(m/z);Q3,161(m/z);T,60(m CXP,20(V);

视黄醇-d4:Q1,273(m/z);Q3,93.8(m/z);T,60(m CXP,12(V);

全反式视黄酸-d6:Q1,307.7(m/z);Q3,123(m/z);T,60(msec);DP,62(V);EP,10(V); CE,18(V);CXP,20(V)。

进一步地，目标待测物的标准储备溶液包括视黄醇标准储备液、全反式视黄 酸标准储备液、9-顺式视黄酸标准储备液、全反式视黄醛标准储备液，视黄醇-d4内标标准 储备液以及全反式视黄酸-d6内标标准储备液，由目标待测物的标准品或内标标准品溶解 在甲醇溶剂中配制而来，浓度均为1mg/ml。

标准曲线工作液包括由W1采用空白基质逐级稀释得到的若干个设  计浓度梯度，所述W1由41.9uL 477.85μg/ml的视黄醇，100μL 10μg/ml的全反式视黄酸，20μ L 10μg/ml的9-顺式视黄酸，20μL 10μg/ml的视黄醛溶于9818.1μL的 5 % BSA中配制而成；标准曲线工作液中，视黄醇的浓度范围为10-2000ng/ml,  全反式视黄酸的浓度范围为0.5- 100ng/ml,9-   顺式视黄酸的浓度范围为0.1-20ng/ml, 视黄醛的浓度范围为0.1-20ng/ml。

内标溶液由10μL 1mg/mL的视黄酸-d6内标和420μL 1mg/mL的视黄 醇-d4内标加入16ml甲醇中配制而成。

待测样本的获得方式为血液样本置于洁净的样本管a 中，加入1000μL甲基叔丁基醚，充分混匀，4℃离心后吸取上清液至样本管b中，室温避光氮气吹干，加入80%甲醇溶液复溶，混匀后离心，上清液即为待测样本。

还包括质控步骤，用来质控的质控品包括高浓度质控品、中浓度质控品 以及低浓度质控品，高浓度质控由800μL W1和200μL空白血清基质混合配制而成，中浓度质 控由100μL W1和900μL空白血清基质混合配制而成，低浓度质控样品由20μL W1和1980μL空 白血清基质混合配制而成。

高浓度质控品中包含：浓度1600ng/mL的视黄醇，浓度80ng/mL的全 反式视黄酸，浓度16ng/mL的9-顺式视黄酸，浓度16ng/mL的视黄醛；

中浓度质控品中包含：浓度200ng/mL的视黄醇，浓度10ng/mL的全反式视黄酸，浓 度2ng/mL的9-顺式视黄酸，浓度2ng/mL的视黄醛；

低浓度质控品中包含：浓度40ng/mL的视黄醇，浓度2ng/mL的全反式视黄酸，浓度 0.4ng/mL的9-顺式视黄酸，浓度0.4ng/mL的视黄醛。

      基于HPLC-MS/MS 的高灵敏度，高特异性，对视黄醇，全反式视黄酸，9-顺式视黄  酸，全反式视黄醛进行检测，通过前处理和质谱方法的同时优化将浓度差异巨大的视黄醇， 全反式视黄酸，9-顺式视黄酸，全反式视黄醛一针进样就可出结果，该方法时长只需 5.2min, 对于大样本量的实验，节约了时间。