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β-1,3葡聚糖酶活性的测定
来源: | 作者:上海优选生物 | 发布时间: 2024-05-31 | 647 次浏览 | 分享到:

植物体内的葡聚糖是由多个葡萄糖残基以β-1,3-糖苷键连接起来的多聚糖化合物,它是真菌细胞壁的主要组成部分。当植物处于逆境条件下或有病的时候,它的体内就会产生大量的β-1,3-葡聚糖酶,将多聚糖水解成糊精或寡聚糖,从而导致细胞壁破裂,真菌细胞逐渐凋亡,在一定程度上抑制了真菌对植物的侵染能力。β-1,3-葡聚糖酶能够作用于葡聚糖的β-1,3-糖苷键,产生还原性末端。因此,利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂测定生成还原糖的量,可以用来表示β-1,3-葡聚糖酶活性。



检测酶活就要用到标准曲线,吸取1mg/ml的葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ml,依次加入25ml的具塞刻度试管中,加入DNS显色剂3ml,沸水浴5min,冷却后加入蒸馏水20ml混匀,在分光光度计的520nm的波长处测定吸光度值。根据浓度和吸光度值之间的关系,制作处对应的标曲曲线。



有了标准曲线,就要测样品了。测样品的吸光度值,结合标准曲线就能计算出样品中的酶活。那么,现在要做的就是对样品进行处理。比如,称取植物样品,在研钵中,加入提取缓冲液,在冰浴的条件下研磨。然后在4℃,高速离心30min,收集上清液,在低温的条件下进行保存备用。



现在,要测酶活了。酶活就是测定酶的作用能力,我们可以用两个反应试管,分别加入底物100ul0.4%的昆布多糖溶液。其中,向一支试管中加入100uL酶液,向另外一支试管中加入100ul煮沸5min后的酶液做对照。同时在37℃的条件下保温40min,保温后分别加入1.8ml的蒸馏水和1.5ml的DNS试剂,最后在沸水浴中加热3min。再用蒸馏水将显色的反应液稀释至24mL,混匀。混合液在分光光度计的540nm的波长处测定吸光度值,可以多次几次求取平均值。


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